码住！这绝对是最易懂的流式细胞实验设计指南！

说到流式细胞，从个人角度上来说，它的实验高速客观，不仅具有统计学意义，能够处理复杂样本并同时获取多种参数，而且最关键的是它性能可靠，可重复性非常好！比起传统的细胞生物学研究手段来讲完全是秒杀的存在了；如果把共聚焦和膜片钳算进去，完全可以说是三足鼎立 ~

但是很多身边的同学反应，在实验中经常有细胞实验失败或数据不理想，小编想了想，最常见的问题应该就是对照设置不合理导致的。因此，今天我们来谈谈成功的流式细胞实验设计都需要设置哪些对照。

如果你掌握了流式实验如何设置对照的精髓，实验成功率一定会上升的。

基本流式对照有5 种：空白对照、生物学对照，同型对照及补偿对照（也叫单阳性对照）和 FMO 对照，其目的是为了避免出现假阳或假阴性的结果。

比如凋亡实验，我们来看看如何设置对照组。下图是 Annexin V/PI 检测凋亡的原理示意图。

Annexin V/PI 检测凋亡的原理示意图

假设两组细胞，一组是用药物处理（Treat 组），另一组用 DMSO 溶剂（Vehicle 组），拟用 Annexin V/PI 检测凋亡，那么需要设置哪些对照呢？

1、生物学对照

其实上述的 Vehicle 组就是生物学对照组。

2、空白对照

在流式上机检测前，我们还需准备额外一组什么染料也不加的细胞当空白对照。因为除了阳性荧光信号之外，我们还需要排除是不是样本本身就自带荧光的背景，所以要设置空白组来验证在各个检测通道上的信号是否都是阴性。

3、同型对照（Isotype control）

众所周知，抗体是个 Y 字形的，Fab 区域是特异性识别抗原的。在做蛋白免疫印迹时只需考虑 Fab 的特异性，但是做细胞的话就有点不同了，因为特别是免疫细胞，它们表面有 Fc 受体，所以这个同型对照是为了评估抗体 Fc 段和靶细胞的结合情况。

对比图

所以在做免疫细胞的流式检测时，我们通常都需要加入 Fc 受体封闭剂，之后再加入目标抗体的 isotype 作为同型对照，来排除细胞 Fc 受体造成的假阳性结果。

4、补偿对照（单阳性对照）

首先来看看什么是荧光补偿。

补偿对照（单阳性对照）

就是使用几种颜色的抗体，就需要设置几种颜色的单阳性对照。这里推荐用补偿微球来作为补偿对照，一是能节约时间和样本，二是，有时候自己做的单阳性对照效果不佳，阳性信号不强，就失去了补偿对照的意义了。

补偿微球的效果

5、荧光减一（FMO，Fluorescence minus one）对照

假设有三种以上颜色的话，就需要再设置 FMO 对照来评估其他荧光染料的干扰和补偿本底，帮助正确设置阳性门。下图演示如果按空白对照组设定界线之后得到的细胞比例比 FMO 设定的值要大。从这个图可以看出，空白对照仅仅是设定阴性界线，但非阴性并不等于就是阳性，所以还需 FMO 来设定阳性界线。

荧光减一（FMO，Fluorescence minus one）对照

综上所述，如果只检测两种颜色的话，至少需要 5 个对照（生物学对照 空白对照 同型对照 2 个单阳性对照）。如果要检测 3 种颜色的话，我们来算算，生物学对照 空白对照 同型对照（可以不同的 isotype 做在同一管里） 3 个单阳性对照 3 个 FMO 对照，一共需要 9 个对照。

荧光减一（FMO，Fluorescence minus one）对照

要是感兴趣的同学比较多，我们下次再继续谈谈样本处理和颜色搭配的问题。